一条基因失去功能，究竟是被“剪掉”了，还是被细胞“修坏”了？答案藏在DNA双链断裂后的修复选择里。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9负责识别并切开目标DNA，真正决定编辑结果的，则是NHEJ或HDR等修复通路。本文将从DNA双链断裂讲起，拆解三类常见编辑工具的工作方式，并介绍海星生物基因敲除服务所采用的大片段删除策略。

DNA双链断裂（DSBs）DSB（DNA double-strand break）是同一DNA分子的两条互补链在相近位置同时断开，DNA骨架的连续性因此被切断。它可由复制压力、辐射或化学损伤自然产生，也可由Cas9等核酸酶定点制造。未及时或错误修复可能造成序列丢失、倒位、易位，甚至细胞死亡；基因编辑则利用细胞随即启动的修复反应，把这次“损伤”转化为可设计的序列改变。


图源：Tan J, et al. MedComm. 2023, Fig.1，CC BY 4.0；DOI：[10.1002/mco2.388](https://doi.org/10.1002/mco2.388)

敲除真正依靠的，是细胞“修DNA”

ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9虽然导航方式不同，核心都相似：先在目标DNA制造DSBs，再借细胞修复形成结果。

1. 非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）

经典同源性非依赖性通路，因为它涉及粘性或平末端的直接连接，并且通常会在此过程中引入小的插入和缺失（indel）。快，但容易“修错”，若indel造成阅读框移位或提前终止，蛋白便可能失活，因此常用于敲除。

DSB出现后，Ku70–Ku80异二聚体（Ku复合体）夹住断端，招募DNA-PKcs形成DNA-PK（可激活Artemis并调节修复）并桥接；Artemis（核酸酶，可切割5'和3'突出端，使其适合连接）和DNA聚合酶按需修剪或补平，最后由XRCC4–XLF–DNA连接酶IV封口。连接可能精确，也可能留下indel；若Cas9靶序列仍完整，会再次被切割，最终常富集造成移码或提前终止的修复结果，实现敲除。

2. 同源定向修复（Homology directed repair，HDR）

使用同源序列作为修复模板，因此是DSB修复的更准确机制。如果用于修复的DNA模板与DSB的原始DNA序列相同，则该过程通常是无错误的，或者如果模板DNA中存在这些修饰，它可以将特定突变引入受损的DNA。提供带同源臂的供体DNA后，细胞可按模板替换或插入序列，适合精准突变、敲入及经典基因打靶；但效率受细胞类型和细胞周期影响，通常比NHEJ更难。

DSB后，MRN_Ctlp切除5′端，形成ssDNA 3'突出端（既可以作为链侵袭所需蛋白质的底物，也可以作为DNA修复合成的引物）；RPA保护单链，BRCA2帮助RAD51装载。RAD51寻找同源序列并完成链侵入，形成D-loop；DNA聚合酶照模板延伸，随后捕获第二断端并连接。实验可提供带同源臂的供体DNA，精准替换或插入。HDR主要发生于有姐妹染色单体可用的S/G₂期，效率通常低于NHEJ。

图1 基因编辑工具及DNA修复结局图源：Duarte F, Déglon N. Front Neurosci. 2020, Fig.1，CC BY 4.0；DOI：[10.3389/fnins.2020.579062]

三种常见“分子剪刀”1. 锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）

ZFN作用需要两个FokI切割区域的二聚化，且至少需要一个识别单元结合DNA，一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应，并最终导致DNA错配和序列改变，当断裂的数目超过了DNA的修复能力会产生较强的细胞毒性。ZFN另外一个缺点是亲和力不高，虽然有公司优化设计用较短接头连接ZF模块可以提高其特异性，但利用此技术来获得高质量基因编辑产品还有较长路要走。

2. 转录激活子样效应子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN）

TALEN是由转录激活因子样效应子(transcription activator-like effector, TALE)，也称为TAL效应子代替了ZNF作为DNA结合域，并与Fok I切割结构域重组而成的核酸酶。TALEN通过TALE识别特异的DNA序列，使Fok I二聚化产生核酸内切酶活性，在特异的靶DNA序列上产生双链断裂以实现精确的基因组编辑。

3.CRISPR/Cas9

是一种由RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。该技术利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。

在这一系统中，其中sgRNA中的crRNA向导序列（20核苷酸）特异性识别并结合目标基因的靶序列，crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体引导Cas9蛋白在crRNA向导序列靶定位点剪切双链DNA产生DSB（双链缺口），达到编辑基因组DNA的目的。在实际应用中，在sgRNA识别的目标基因的靶序列后必须要有一段PAM序列辅助sgRNA中向导序列的靶向定位。PAM序列即原间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motifs），其一般形式为NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的DNA序列中。

图2 ZFN、TALEN与CRISPR-Cas9结构比较图源：Ashmore-Harris C, Fruhwirth GO. Clin Transl Med. 2020, Fig.1，CC BY 4.0；DOI：[10.1186/s40169-020-0268-z]

海星生物采用什么方法？

海星生物的CGKO基因敲除细胞系服务以CRISPR/Cas9大片段删除为核心：根据目标基因结构设计成对或多条gRNA，在关键外显子两侧制造DNA双链断裂；细胞通过NHEJ重新连接断端后，目标片段被删除，从而使基因功能缺失。与依赖单个小indel的移码策略相比，大片段删除的边界更明确，也便于通过跨断点PCR和测序确认。对于难以获得单克隆、完全敲除可能影响生长，或需要先观察表型的项目，还可选择基因敲除Cell Pool方案。


图3 海星生物基因敲除技术原理


服务通常包括：细胞与靶基因评估→gRNA设计及编辑体系准备→细胞转染或电转→筛选与扩增→PCR及测序验证DNA编辑→单克隆分离与筛选→WB等方法验证蛋白敲除→扩增、冻存与交付。具体步骤会根据细胞类型、靶基因以及单克隆或Cell Pool方案进行调整；Cell Pool可先用于快速表型评估，效果符合预期后再继续单克隆筛选。具体方案可联系海星生物进行技术咨询。



图4 海星生物基因敲除技术流程

海星生物（HySigen Biosciences）是一家聚焦基因编辑与细胞工程前沿技术的研发型科技公司，总部位于苏州，致力于为生命科学研究、精准医学诊断及生物制药开发提供核心工具与整体解决方案。公司建有超1200㎡符合国际标准的研发与生产平台，涵盖GMP-like细胞工程实验室、分子生物学中心及SPF级动物实验设施，技术团队由50余位资深科研人员组成，在CRISPR基因编辑、稳转细胞系构建、病毒载体包装等领域拥有深厚积累。

在基因敲除服务方面，海星生物的Cas9-Cell Line Gene Knock-Out（CGKO）平台已累计完成超500个基因编辑项目，构建了覆盖15个癌种、上万个人源基因的敲除细胞库。其优化后的Cas9X系统采用Cas9蛋白与gRNA复合物直接电转，敲除效率是传统质粒法的3-5倍；结合ClonePlus™技术，效率可再提升10-15倍，最快5周即可交付纯合敲除单克隆。服务提供包抗体、包WB验证的质量承诺，交付的敲除细胞株均经PCR和测序双重验证。其构建的ALB敲除HepG2细胞系已助力客户发表IF 81.2的高水平研究论文——让您的基因功能研究，从海星生物的高质量敲除细胞株开始。


技术服务:CRISPR/Cas9细胞基因编辑、CRISPR文库筛选/文库病毒/载体构建、分子诊断参考品/突变基因参考品/融合基因参考品、细胞稳转/细胞干扰

细胞试剂:HyCyte干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、细胞专用培养基、基因编辑试剂盒、病毒现货、预筛选胎牛血清